Klaren en Flocculatie

door: Jaap van der Veen en Chris Talbot

Klaren (helder worden)

Het helder worden van bier omvat veel factoren, van biochemisch tot mechanisch. Een helder bier is het resultaat van goede brouwtechnieken, kennis over de grondbeginselen van klaren, een goed filtersysteem, of een combinatie van alle drie. Tijdens het brouwproces kan men drie soorten troebelheid tegenkomen.

1. Blijvende troebelheid, veroorzaakt door een (bacteriële) infectie of doordat de zetmeelomzetting door het maischproces niet volledig is afgerond.
2. Koude-troebeling, ook wel eiwittroebeling genoemd, veroorzaakt door het binden van eiwitten of bij schommelingen in temperatuur. Deze troebeling doet zich voor bij lage temperaturen en lost weer op bij hogere temperaturen.
3. Gisttroebeling, dit hangt af van het flocculatiekarakter van de gebruikte gist, maar zal tijdens het koelingsproces verdwijnen. In tarwebieren is enige troebelheid vaak juist gewenst.

Een troebel bier wordt vaak toegeschreven aan gist die niet wil uitzakken, maar dat is maar een van de mogelijkheden. Gist blijft niet in suspensie zonder de juiste omstandigheden.

Flocculatie (uitvlokking of samenklontering)

Uitvlokking duidt op de mate waarin gist in staat is om samen te klonteren en grote ‘vlokken’ te vormen en dan uit (suspensie) te zakken. De definitie van uitvlokking luidt ‘omkeerbaar, aseksueel en calcium-afhankelijk proces waarbij cellen zich aan elkaar hechten tot vlokken’.

Het is belangrijk om de basisprincipes van uitvlokking te begrijpen en hoe deze te beïnvloeden, omdat het uitvlokkings- en bezinkingsproces de eenvoudigste en goedkoopste manier is om helder bier te krijgen. Uitvlokking beïnvloedt eveneens het vergistingsproces en de smaak van het bier. Onder ideale omstandigheden blijft gist in suspensie en gaat het pas samenklonteren wanneer het gewenste eind SG is bereikt. Zoals de meeste brouwers weten, houdt gist zich niet altijd aan dit ideale scenario.

De eigenschappen van de verschillende giststammen variëren van niet-uitvlokkend (1007 German Ale) tot zeer uitvlokkend (1968 London ESB).

Niet-uitvlokkende gist

Gist die niet uitlokt heeft cellen die er glad uitzien onder een rasterelektronenmicroscoop en een negatieve oppervlaktespanning hebben. Wanneer deze gistcellen langzaam in suspensie zweven, stoten ze elkaar af (in tegenstelling tot gist die wel uitvlokt). Wanneer ze snel genoeg met elkaar botsen, zullen ze elkaar niet meer afstoten, maar ook zullen ze niet aan elkaar klonteren.

Uitvlokkende gist

Gist die juist wel de neiging heeft om (al dan niet snel) uit te vlokken, heeft cellen die er onder de rasterelektronenmicroscoop uitzien alsof ze haartjes of stekels hebben. Ook deze cellen hebben trouwens een negatieve oppervlaktespanning die ervoor zorgt dat ze elkaar afstoten. Echter, wanneer ze onderling botsen, zal het afstoten eenvoudig teniet worden gedaan en klonteren ze samen.

Lectin Hypothese

De Lectin hypothese is de actuele hypothese die beschrijft hoe gist uitvlokt/samenklontert. Deze hypothese beschrijft uitvlokking door middel van celwand-interacties, specifiek de binding tussen zymolectine en mannose-resten van mannan in de celwanden. 

Mannan bestaat uit lange vertakkingen van mannose-suikerketens die aanwezig zijn in de celwand. Mannan is aanwezig in de celwanden van alle gistcellen en zit vast aan lange peptideverbindingen die verankerd zijn in de celwand.

Zymolectines zijn eiwitten welke door de gistcel worden geproduceerd en vervolgens worden uitgescheiden in de celwand. Zymolectines binden zich graag aan suikermoleculen en hebben calciumionen nodig om deze binding in stand te houden. Zymolectines binden eveneens aan mannose-resten van mannan in de celwand.

Het kleven van zymolectine aan celwand-mannanen werkt eigenlijk net als klittenband. Wat de productie en activitatie van zymolectine veroorzaakt is nog niet bekend. Er wordt verondersteld dat zymolectine actief wordt na exponentiële groei, tijdens de stationaire fase. Waarschijnlijk veroorzaakt de uitputting van voedingsstoffen en de toename van vergistingsbijproducten (ethanol en veranderingen in pH) de productie en activatie van zymolectine.

Er zijn twee fenotypes in giststammen te onderscheiden aan de hand van het type zymolectine dat ze produceren.

Flo1 fenotype

In het Flo1 fenotype binden zymolectines zich alleen aan resten van mannose en de zymolectines worden alleen geremd door mannose. In dit gisttype wordt flocculatie niet beïnvloedt door de groeifase van de gist. De meeste bovengisten vallen onder dit fenotype.

NewFlo fenotype

In het NewFlo fenotype binden zymolectines zich zowel aan mannose- als aan glucoseresten en worden geremd door mannose, glucose, maltose en sucrose. Flocculatie treedt laat in de exponentiële fase op en aan het begin van de stationaire fase. Dit fenotype bevat de meeste ondergisten en enkele bovengisten.

Co-flocculatie

Co-flocculatie kan optreden wanneer een flocculente en een niet-flocculente stam samen worden gebruikt. De combinatie van de twee uitvlokkingstypes kan ervoor zorgen dat beide stammen uitvlokken omdat de zymolectinen van de uitvlokkingsstam binden aan mannanen van de niet-flocculerende stam. Het is moeilijk te voorspellen of twee stammen co-flocculatie zullen vertonen, dus het is altijd belangrijk om kleinschalige fermentatieproeven uit te voeren voordat twee stammen samen worden gebruikt.

Factoren die de samenklontering en aantrekking (flocculatie) van cellen bevorderen

De lectin hypothese beschrijft het mechanisme dat ervoor zorgt dat gistcellen samenklonteren, maar welke factoren bevorderen dit mechanisme?

• Genetische achtergrond van de soort:
  • Om flocculatie te laten plaatsvinden, moet de stam de FLO-genen dragen die verantwoordelijk zijn voor het coderen en reguleren van de productie van FLO-eiwitten;
  • FLO-genen zijn erg onstabiel en hebben extreem hoge mutatiefrequenties;
  • Inherente instabiliteit leidt tot verlies van FLO-genen en verlies van uitvlokkingskenmerken.
• Zymolectine-concentratie:
  • Een toename van de zymolectineconcentratie in de celwand veroorzaakt flocculatie;
  • Factoren die zymolectine verhogen, zijn onder meer:
    • Uitputting van voedingsstoffen;
    • Toename van fermentatiebijproducten.
  • Mechanische factoren die botsingen tussen cellen en samenklontering vergroten:
    • Turbulentie veroorzaakt door CO₂-productie;
    • Temperatuurgradiënten;
    • Hogere celconcentratie.
  • Factoren die afstotende elektrostatische lading verminderen:
    • Ethanolconcentratie;
    • pH;
    • Veranderingen in de samenstelling van de celwand.
  • Factoren die de waterafstotende eigenschappen van het celoppervlak verhogen:
    • Verhogingen van de oppervlakte-eiwitconcentratie;
    • Toename van de zymolectinedichtheid door de waterafstotende gebieden van dit eiwit;
    • Verandering in de verhouding van fosforrijke tot stikstofrijke polypeptiden in de celwand
    • Een toename van de productie en ophoping van oxylipiden, sterolen en vetzuren in de celwand.
  • Vermindering van zymolectine-remmende suikers. Tijdens de fermentatie zullen suikers die actief binden aan zymolectines door gist worden geconsumeerd; dit zal deze oppervlaktes beschikbaar maken voor celwandmannanen.
  • Celleeftijd:
    • Oudere gistcellen hebben de neiging om ruwere en meer gerimpelde celwanden te hebben dan maagdelijke cellen, waardoor hun bindingsvermogen toeneemt;
    • Oudere cellen hebben de neiging om een meer fijndradige groei te hebben en kunnen een hogere dichtheid van zymolectines in de celwand hebben.

Wat betekent dit alles voor de thuisbrouwer?

Flocculatie en klaring zijn complexe kwesties en worden beïnvloed door vele factoren. Sommige van deze factoren liggen buiten de controle van de thuisbrouwer, terwijl andere wel te sturen zijn. Het manipuleren van factoren die flocculatie beïnvloeden, heeft een directe invloed op de smaak en het aroma van het eindproduct.

• Beluchting:
  • Slechte of onvoldoende wortbeluchting kan leiden tot vroege en onvolledige flocculatie;
  • Adequate beluchting kan resulteren in een vertraagde en intensere flocculatie;
  • Beïnvloedt sterol- en vetzuursynthese en vermoedelijk waterafstotendheid van de celwand.
• Temperatuur:
  • De optimale flocculatietemperatuur kan variëren tussen stammen;
  • Onderzoeksproeven met lagerstammen hebben aangetoond dat flocculatie optimaal is bij 50°F (10°C) en aanzienlijk afneemt onder 41°F (5°C);
  • Flocculatie voor één lagerstam nam toe toen de temperatuur werd verhoogd van 41°F (5°C) naar 77°F (25°C);
  • In andere onderzoeksproeven werd flocculatie onderdrukt bij 77°F (25°C) en was optimaal bij 41°F (5°C);
  • Door de vergistingstemperatuur te verlagen, wordt de CO₂-productie door de gist verminderd, waardoor er minder turbulentie ontstaat en uitzakking wordt bevorderd;
  • Het bijhouden van eerdere resultaten helpt bij het bepalen van het optimale temperatuurbereik.
• pH:
  • Flocculatie wordt beïnvloed door de pH van het wort;
  • Flocculatie kan optreden in een breed pH bereik van 2.5 tot 9.0;
  • Het optimale bereik is 3.5 pH tot 4.8 pH en verschilt per giststam;
  • Giststammen van het NewFlo-fenotype komen voor bij een pH van 3.9 tot 5.5 en kennen een zeer stamspecifiek optimaal bereik.
• Ethanolconcentratie:
  • Onderzoeken tonen aan dat zowel verhogingen als verlagingen van ethanolniveaus flocculatie kunnen versterken;
  • Sterk giststamafhankelijk;
  • Een te hoge concentratie (10%) wordt giftig voor de gist.
• Ent hoeveelheid:
  • Onderzoek toont verhoogde flocculatie bij NewFlo stammen bij een geleidelijke verhoging van de pitch rate;
  • Pitchrate werd verhoogd van 1 miljoen cellen/ml naar 15 miljoen cellen/ml;
  • Flocculatie nam toe van 58% naar 71%;
  • Hogere pitch rates kunnen populaties opleveren met hogere percentages oudere cellen.
• Trub:
  • De invloed van trub-niveaus op flocculentie varieert sterk tussen giststammen;
  • Bij pH-waarden onder 4.0 vinden elektrostatische interacties plaats tussen trub- en gistcellen, wat leidt tot kleverige gistbedden bij de productie van koolhydraatarme bieren.

Gistbehandeling en flocculatie/klaring

Ent-hoeveelheden:

• Standaardiseer ent-hoeveelheden:
  • Door de ent-hoeveelheden gelijk te houden wordt het mogelijk om andere oorzaken voor veranderingen in flocculatie te bepalen.
• Gist oogsten:
  • Het oogsten van gist voor later hergebruik is erg belangrijk voor het behoud van goede uitvlokkingseigenschappen.
  • Het oogsten uit verschillende lagen kan worden gebruikt om de flocculatie-eigenschappen aan te passen en te behouden. Oogsten uit de middelste gistlaag in het gistbed zal de hoogste flocculatie opleveren. Bij thuisbrouwers zullen de verschillende lagen echter moeilijk te bepalen zijn, aangezien vergistingsvaten onderaan vaak plat zijn. Het oogsten zal resulteren in een combinatie van gist uit alle lagen die zal variëren in levensvatbaarheid, vitaliteit en flocculatie-eigenschappen.

Generatie:

• De flocculatie van een giststam zal veranderen door herhaaldelijk hergebruik. Dit komt door veranderingen in de samenstelling van de celwand en genetische variatie;
• Zeer stamafhankelijk: sommige giststammen zijn veel stabieler dan andere.

Conclusie

Flocculatie is een van de meest complexe en minst begrepen mechanismen van gist. Het is erg moeilijk om precies te bepalen waarom de flocculatie-eigenschappen van een giststam veranderen. Het goed bijhouden van eerdere resultaten in combinatie met goede en consistente brouwtechnieken zal het aantal onbekende factoren die van invloed zijn op gist minimaliseren.

Bron

https://wyeastlab.com/resource/home-enthusiast-clarification-flocculation/