Terug naar overzicht

Lysozyme

tww november 1999
Door: Theo van de Voorde

 

Lysozyme


Onderstaand artikel is in janauari jl. verschenen op de Amerikaanse website van het bierbrouwblad Brew en is geschreven door Jessica Just, een vertegenwoordigster van Scott Labs. Het is vertaald en bewerkt in het Nederlands door Theo van Voorde.

Stop de bacteriën met Lysozyme, een enzym dat geïsoleerd is uit kippenei-eiwit. Lysozyme kan zowel worden gebruikt als preventief conserveringsmiddel of voor het reinigen van een besmette wort of giststarter. Bijna ieder thuisbrouwer die ik ken heeft de ontmoedigende ervaring gehad van een brouwsel dat bedorven was als gevolg van een bacteriële besmetting. Ik wou dat ik kon zeggen dat na 13 jaar thuisbrouwen (en een paar jaar studie in de voedsel wetenschap) elk bier dat ik maak perfect is, maar dan zou ik liegen. De waarheid is dat potentieel schadelijke micro-organismen overal aanwezig zijn en sommige daarvan zouden in je bier terecht kunnen komen, ondanks dat je uiterste best gedaan hebt om ze eruit te houden.

De eerste verdedigingslinie van een thuisbrouwer tegen verderfelijke micro-organismes zal altijd het grondig schoonmaken en vervolgens ontsmetten van zijn uitrusting zijn. De tweede linie is het nemen van maatregelen om, de in de lucht zwevende, bacteriën te beletten in het wort of het bier te vallen. Er is echter een nieuwe stap die een thuisbrouwer kan nemen om het risico van een besmetting en verspilling te voorkomen: dat is het toevoegen van Lysozyme.

Bacteriële besmetting kan bier in een zintuiglijke nachtmerrie veranderen. Bacteriën veroorzaken nare geuren en aroma’s, stilgevallen of trage vergisting, ze produceren zuur en zijn soms de oorzaak van "draderigheid", d.i. de aanwezigheid van kleverige draden of klodders in het bier.

Bacteriesoort bepaling volgens Dr. Gram

De term Gram-positief en -negatief duidt op een bepaalde kleuring die in het lab wordt uitgevoerd bij het identificeren van bacteriën. Als met de bedoelde kleurmethode de bacteriën effectief kleuren heten ze ‘Gram-positief, en vice versa. Vervolgens kan men met andere testen verder uitzoeken met welke bacterie men te maken heeft. Dat de term hier wordt gebruikt heeft er ook mee te maken dat bepaalde antibiotica soms enkel werkzaam zijn tegen Gram-positieve, of enkel tegen Gram-negatieve kiemen.

Bij het brouwen is het meest opvallende lid van de groep Gram negatieve bacteriën de Azijnzuurbacterie, die bekend staat om zijn mogelijkheid om grote hoeveelheden azijnzuur te vervaardigen uit alcohol.

De meest bekende groep van Gram-positieve bacteriën verbonden met bier zijn bekend onder de gemeenschappelijke naam van melkzuurbacteriën. Onder de leden van deze groep vallen de Lactobacillus en Pediococcus en ze worden melkzuur bacteriën genoemd vanwege hun eigenschap om suikers om te zetten in melkzuur. Sommige melkzuurbacteriën zijn ook in staat om grote hoeveelheden azijnzuur te maken.

Lactobacillus vóór behandeling met lysozyme   lactobacillusnabehandeling
Figuur 1: Lactobacillus voor behandeling met Lysozyme   Figuur 2: Lactobacillus na behandeling met Lysozyme

In het algemeen zetten de melkzuurbacteriën wortsuikers om. Hun groei wordt bevorderd onder anaerobische (= zonder de aanwezigheid van zuurstof) omstandigheden. De meest voorkomende geuren verbonden met deze bacteriën zijn zoet, butterscotch- of honingachtig en worden veroorzaakt door diacetyl en aanverwante chemische stoffen. Ze vermeerderen zich optimaal bij een pH van 5,5 en kunnen nog overleven bij een pH van 3,0. (De pH van wort ligt gewoonlijk tussen de 5,2–5,6; uitgegist bier heeft gewoonlijk een pH van 4,0–4,4.) Ze vermeerderen zich bij een wijd temperatuurbereik en zijn bestand tegen alcohol. Hopharsen kunnen de groei van melkzuurbacteriën vertragen maar door hun aanpassingsvermogen zijn de melkzuurbacteriesoorten die in de bierbrouwomgeving voorkomen, vaak resistent geworden voor hop. Per saldo vormen wort en bier een ideale omgeving voor melkzuurbacteriën om zich te vermeerderen en ze kunnen zodoende bier in elk stadium van het brouwproces besmetten.

De aanwezigheid van bacteriën is niet altijd een ongewenste gebeurtenis. Inderdaad, bieren zoals lambics en andere zure bieren zijn afhankelijk van de activiteit van melkzuurbacteriën evenals van andere micro-organismen om een specifiek smaakpalet te ontwikkelen. Bovendien kan bacteriegroei gebruikt worden in het voordeel van de brouwer om op natuurlijke wijze de zuurgraad van de maisch te verhogen. Wanneer de maischtemperaturen beneden de 60 °C gehouden worden, zullen bepaalde soorten thermoresistente (= hitte bestendige) melkzuurbacteriën melkzuur produceren om bewust de maisch pH te verlagen. Bij het wijnmaken wordt de groei van bepaalde melkzuurbacteriën feitelijk aangemoedigd om de appelzuur vergisting te doen starten. Hierbij wordt het scherpe appelzuur omgezet in het mildere melkzuur. Melkzuurbacteriën worden ook toegepast bij het vervaardigen van voedselproducten zoals zuurkool, yoghurt, kaas, salami and Thaise vissaus.

Lysozyme

Lysozyme is een uitvoerig onderzocht enzym dat bescherming kan bieden tegen een breed spectrum van Gram-positieve bacteriën. Het wordt gebruikt als conserveringsmiddel in vele voedselproducten zoals wijn, tofu, kaas en sake. Het gebruik van Lysozyme in bier heeft pas onlangs de aandacht getrokken en de toepassing bij het bierbrouwen, met name voor de kleine brouwers maar ook de thuisbrouwers, zijn ontelbaar.

Alexander Fleming ontdekte Lysozyme in 1922 toen de geleerde verkouden was. Hij merkte dat druppels die uit zijn neus op een plaat agar waren gevallen, bacteriekolonies oplosten. Fleming stelde al snel vast dat de anti-bacteriële actie een gevolg was van een enzym dat effectief was tegen bepaalde bacteriën. Lysozyme is van nature aanwezig in traanvocht, moedermelk en speeksel en maakt deel uit van het menselijk afweersysteem. Commerciëel Lysozyme wordt geïsoleerd uit kippenei-eiwit. (Er zijn ongeveer 10.000 eieren nodig om 1 kg Lysozyme te maken!)

Lysozyme is effectief tegen Gram-positieve bacteriën (alle melkzuurbacteriën) door zijn vermogen om met name de celwandstructuur van deze micro-organismen te doorbreken. Dit gebeurt door het doorknippen van verbindingen in de Peptidoglycan laag, welke bij Gram-positieve bacteriën het grootste deel van de celwand vormt. Hierdoor verzwakt de celwand, en barst deze als gevolg van de osmotische druk in de cel, waardoor de cel als het ware leegloopt en de bacterie sterft. Bij Gramnegatieve bacteriën is de peptidoglycan laag veel dunner en bovendien afgeschermd door een extra membraan. Hierdoor zijn de meeste gram negatieve bacteriën en ook gist ongevoelig voor de werking van lysozyme. Het meest geschikte tijdstip om Lysozyme in het brouwproces toe te passen, zijn dus de momenten waarop melkzuurbacteriën de gelegenheid hebben om je bier te infecteren en te bederven.

Maischen

Bepaalde thermofiele (warmteminnende) melkzuurbacteriën kunnen de maisch bederven. Omdat de thermofiele bacteriën (heel vaak leden van het geslacht Bacillus) zeer gevoelig zijn voor hop en zullen deze niet overleven in gehopte wort. Alle andere, niet thermofiele, melkzuurbacteriën die in the maisch terecht komen worden tijdens het koken gedood. Bij een standaard maischduur van 60–90 minuten welke onmiddellijk wordt gevolgd door het filteren van het wort, zal bacteriegroei niet relevant zijn. Echter als de maisch een nacht wordt overgehouden en de temperatuur onder de 60 °C komt, zal de maisch zuur worden door de activiteit van de melkzuurbacteriën. Brouwers die zo werken kunnen hun maisch met Lysozyme beschermen . Zij zullen echter moeten wachten tot de temperatuur gezakt is tot 62 °C om het middel toe te voegen, wat misschien niet praktisch is.

Wort koelen

Tijdens het koelen van het wort, is deze gevoelig voor besmetting. Om deze reden is het erg belangrijk om het wort snel te koelen en vervolgens zo snel mogelijk de gist, die een schone en actieve gist moet zijn, toe te voegen. Misschien is het beste tijdstip om Lysozyme toe te voegen, het moment waarop de gist wordt toegevoegd. (Dit omdat tijdens het toevoegen van de gist er de kans op een bacteriële besmetting het grootst is). Om deze reden is het niet zinvol om Lysozyme toe voegen gedurende het wort koelen. Als echter het wort enige tijd moet staan voordat de gist erbij wordt gedaan, kan Lysozyme wel worden toegevoegd aan het koelende wort in een verhouding van 1 theelepel (3 gram) op 20 L (150 ppm) zodra de temperatuur beneden de 62 °C komt

Gist toevoegen

Het toevoegen van gist is, gezien het aantal mogelijkheden dat bacterën tijdens het brouwproces kunnen toetreden, de meest belangrijke oorzaak van besmetting. Het is dus duidelijk dat dit het meest geschikte moment is om Lysozyme toe te voegen.

Besmetting van de gist is ook mogelijk bij het gebruik van gedroogde gist. Ondanks het feit dat er enorme vorderingen zijn gemaakt bij de techniek van het gistdrogen wordt gedroogde gist (nog) niet vervaardigd onder steriele omstandigheden en er is dus een groot risico om onbedoeld melkzuurbacteriën te introduceren via de gisttoevoeging.

Een schone, actieve gistsuspensie is een uitstekende manier om besmetting te voorkomen. Veel, misschien zelfs de meeste thuisbrouwers vertrouwen voor elk brouwsel op het gebruik van een nieuwe gistcultuur van vloeibare gist. De gist van de producenten van vloeibare gist is in principe vrij van besmetting en dus veilig om toe te voegen. Met de juiste voorzorgen op het gebied van schoonmaken en ontsmetten kunnen thuisbrouwers een gezonde giststarter maken met een minimum aan ongewenste microbiële groei. Veel thuisbrouwers slagen er zelfs in om hun gist te hergebruiken voor meer dan één brouwsel.

Wanneer gist wordt gebruikt of hergebruikt kan Lysozyme worden toegepast om eventuele melkzuurbacteriën te doden, mochten deze aanwezig zijn. Lysozyme kan worden toegevoegd zowel bij het gebruik van gedroogde als bij verse gistculturen. Door het Lysozyme poeder te mengen met de gedroogde gist kan besmetting door melkzuurbacteriën voorkomen worden bij het oplossen van de gist. Het toevoegen aan zowel droge als aan vloeibare gist zal leiden tot een restant aan Lysozyme in het te vergisten wort. Een "snufje" Lysozyme in een giststarter van een liter is alles wat nodig is.

Er is nog een manier om de toe te voegen gist te reinigen: wassen met zuur. Dit is een techniek die door sommige professionele brouwers wordt toegepast om hun gist te reinigen voordat hij wordt toegevoegd aan het wort. Het is een proces waarbij Fosforzuur wordt toegevoegd aan de uit het vorige brouwsel afkomstige gist teneinde de pH te verlagen. De bedoeling hiervan is de eventueel aanwezige bacteriën en zwakke gistcellen te doden en daarbij alleen de levende, actieve gistcellen over te houden. Toch kan op deze manier schade toegebracht worden aan de gistcultuur en niet altijd worden alle bacillen gedood. Deze techniek reduceert slechts het aantal bacteriën en kan niet beschouwd worden als een totale remedie. De praktijk van het gistwassen valt waarschijnlijk buiten het bereik van de meeste amateurbrouwers. (En, voor wat het waard is, veel professionele brouwers houden er helemaal niet van).

Het toevoegen van Lysozyme aan verse gistculturen kan gezien worden als alternatief voor het wassen van gist met zuur om de gist op te schonen. Denk er echter aan dat, in tegenstelling tot het wassen met zuur, Lysozyme niet alle soorten bacteriën doodt.

Tijdens de vergisting

Als er een besmetting met bacteriën wordt vermoed kan Lysozyme gebruikt worden om verdere groei van melkzuurbacteriën te voorkomen. Als er melkzuurbacteriën aanwezig zijn in het vergistende wort, zijn ze eerder afkomstig van de toegevoegde gist dan dat ze aanwezig waren in het oorspronkelijke wort. Wanneer echter open vergistingtanks worden gebruikt of wanneer de uitrusting niet goed is gereinigd, kan zich een besmetting in dit stadium voordoen.

Dus, als de hoofdvergisting stopt of voortijdig heel traag wordt gebruik dan Lysozyme om het wort te stabiliseren; de vergisting dient echter opnieuw gestart te worden.

Gebruik 1 theelepel van het poeder per 20 L wort.

In gereed bier

Lysozyme kan aan het eindproduct toegevoegd worden. Onderzoek heeft uitgewezen dat een Lysozyme toevoeging van 150 ppm hoog genoeg is om de ervoor gevoelige bacteriën te elimineren en toch nog gedurende langere tijd actief te blijven zonder veel te veranderen aan de fysische eigenschappen van het bier. De toe te voegen hoeveelheid is ook hier 1 theelepel (3 gram) poeder per 20 bier.

Bij het voorkomen van ongewenste microbacteriële groei in wort en in bier kan niets de hygiëne in het brouwhuis en zindelijkheid in het algemeen vervangen. Met behulp van de juiste technieken is het mogelijk om keer op keer een schoon, onbesmet bier te brouwen. Micro-organismes echter zijn overal en thuisbrouwers maken zich regelmatig zorgen over de mogelijkheid van een besmetting. Lysozyme is een extra hulpmiddel bij het beheersen van micro-organismen die voorheen niet beschikbaar waren voor de thuisbrouwer.

Lysozyme: Veel gestelde vragen

Hoe lang duurt het voordat Lysozyme begint te werken?
De mate van activiteit hangt af van veel factoren waaronder temperatuur, pH, hoeveelheid bacteriën en hun resistentie. Hoewel Lysozyme onmiddellijk begint te werken worden niet meteen alle bacteriën gedood.

Bij welke temperatuur is Lysozyme het meest actief?
Lysozyme heeft een optimale activiteit tussen 40 - 45 °C, maar zal actief blijven tot aan 62 °C. Als Lysozyme wordt toegevoegd bij lagere temperaturen, zal de mate van activiteit licht afnemen, maar niet stoppen.

Bij welke pH is Lysozyme het meest actief?
De activiteit van Lysozyme is het grootst bij een pH van 3,5 tot 7,0.

Is Lysozyme effectief tegen alle melkzuurbacteriën?
Nee. Van een paar soorten melkzuurbacteriën is gebleken dat ze resistent zijn tegen Lysozyme.

Hoe lang blijft Lysozyme in bier?
De hoeveelheid achterblijvende Lysozyme hangt af van het type bier, tijdstip van toevoeging, oorspronkelijke bacteriehoeveelheid en de hoeveelheid die wordt toegevoegd. Het verlies aan activiteit is het grootst in donkere bieren, die meer polyphenolen bevatten. Onderzoek heeft aangetoond dat Lysozyme relatief stabiel is in bier en tenminste 50% van zijn activiteit behoudt over een periode van 6 maanden wanneer het is toegevoegd aan het gebottelde bier.

Veranderen de eigenschappen van het bier door Lysozyme?
Volgens onderzoek dat is verricht door Dr. Mark Daeschel van de Oregon State University, heeft Lysozyme minimale effecten op de fysische en zintuiglijke eigenschappen van bier. Daeschel heeft aangetoond dat wanneer Lysozyme gebruikt wordt in een maximale hoeveelheid van 200 ppm, er geen koude waas en geen aantasting van de schuimstabiliteit plaats vond. Lysozyme heeft ook getoond dat het geen invloed heeft op de smaak en het aroma van bier. Twee zintuiglijke onderzoeken (ook op het OSU) werden uitgevoerd door zowel een panel van gewone consumenten als een professioneel panel van de brouwindustrie. Geen van beide panels kon een verschil ontdekken tussen de bieren die met Lysozyme behandeld waren en die welke dat niet waren.

Hoe zullen klaringsmiddelen reageren op Lysozyme?
Lysozyme is een eiwit en zal worden verwijderd door elk klaringsmiddel dat eiwitten doet neerslaan.

Wanneer ik Lysozyme voor het koken toevoeg zal het dan nog actief zijn in het vergistende wort en in het gebottelde bier?
Nee. Lysozyme verliest al zijn activiteit bij 62 °C wordt dus gedeactiveerd gedurende het koken.

Hoe lang kun je Lysozyme bewaren?
Wanneer het bij kamertemperatuur en in en droge omgeving wordt bewaard in een afgesloten doos of blik behoudt het Lysozyme poeder 95% van zijn activiteit gedurende vijf jaar. Een waterige oplossing van 22% Lysozyme die gedurende een periode van 12 maanden in een koelkast werd bewaard bij maximaal 7 °C heeft bewezen meer dan 90% van zijn activiteit behouden te hebben.

Lysoyzme wordt in Nederland geproduceerd door Inovatech Europe B.V. te Zeewolde.

Terug naar overzicht